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类器官（Organoids）是指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。其与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧密的细胞间，细胞与基质间高度相互作用，形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究、临床诊疗、药物模型等多方面均具有广阔的应用前景。

 

然而在类器官培养过程中的拍摄及定量分析有着许多挑战：

1、人工手动操作拍摄类器官图像，费时耗力通量低；

2、频繁采集过程当中环境变化对类器官带来影响；

3、常规显微镜下仅能得到类器官面积信息，数据量少；

4、孔板中拍摄位点难以全面选取，重复性难以保证。

 

Holomonitor M4强大的全息动态监测及分析功能助您轻松解决类器官拍摄过程中的痛点，Holomonitor M4机身小巧可在培养箱中长期无标记实时监测类器官避免环境变化干扰；针对不同的孔板可进行多处自由选点保证实验重复性，最高可进行96孔板监测；3D成像及强大的分析功能不仅可以提供类器官面积形态变化信息，更能给与体积及迁移等丰富信息。

 

下面给大家分享一篇类器官拍摄及定量分析案例。

案例一

 

 

 

口咽鳞状细胞癌（OPSCC）干细胞具有自我更新和分化成肿瘤异质三维结构的能力。David等人采用实时数字全息显微镜（Holomonitor M4）对口咽鳞状细胞癌进行肿瘤类器官形成观察。监测结果展示了肿瘤-类器官形成早期细胞聚集的过程，并可对类器官面积及光学体积进行筛选。随后David等人对OPSCC上皮细胞进行分选，通过M4对不同表型的细胞运行及生长观察结果表明CD44＋细胞表现出更大的运动性和肿瘤形成能力。Holomonitor M4提供了一种简单无标记的肿瘤类器官长期监控分析，可用于评估类器官形成过程、类器官生长面积及体积量化分析、类器官迁移追踪及药物筛选。

  

应用一

监控类器官形成数量，评估类器官最佳接种密度。

 

亮点：Holomonitor M4机身小巧可在培养箱中长期无标记实时监测类器官避免环境变化干扰。

 

本文通过15小时连续观测不同接种密度下细胞发生聚集形成类器官时间，并通过光学厚度的数据来评估整体生长状况。结果表示接种密度100个细胞/ μL可产生102个±36个类器官/mm²;1000 个细胞/μL 产生 47 ± 34 个类器官/mm²。接种密度会影响类器官的大小和光学性质，细胞之间的密切接触，有利于类器官的形成。

图1: 用HoloMonitor M4成像测定类器官的接种密度条件和光学性质。口咽鳞状细胞癌（OPSCC）细胞在以（a）100和（b）1000个细胞/ μL的密度接种后15小时成像，（c）散点图显示使用不同接种密度获得的类器官的光学体积和厚度。

 

 

应用二

长期监控并实时量化类器官生长状态

 

亮点：HoloMonitor M4 3D成像及强大的分析功能，实时量化类器官面积及体积变化信息。

 

本文通过15小时联系观测，评估影响类器官形成和生长的事件，结果表明显示类器官在接种后2 h开始形成，并通过面积和光学厚度随时间的增加来监测整体生长。在最初的8小时内，细胞聚集主导了类器官的形成；在8-15 h时类器官完全形成，并显示出稳定的直径和光学厚度测量结果。

 

图2：使用M4监测15小时内的类器官形成情况。（a）水凝胶嵌入培养系统不同时间点（0,7.5和15小时）捕获的M4图像。（b）五个类器官在15小时内的面积和光学体积增加情况。

  

 

应用三

不同基因型细胞形成类器官能力及其运动情况分析

 

亮点：HoloMonitor M4可针对不同的孔板可进行多处自由选点，可以保证实验重复性；强大的分析功能给出细胞迁移距离及速度等丰富信息。

 

在OPSCC类器官形成过程中，14%细胞没有形成任何3D结构，表明可能存在具有不同类器官形成能力的细胞亚群。通过根据CD44和NGFR（表达对单个OPSCC细胞的类器官形成能力和运动差异性进行分类来进行评估。分选后三种不同表型的细胞，CD44 +/ NGFR+，CD44+ / NGFR−和 CD44−/NGFR−，在水凝胶中接种并使用HoloMonitor M4进行跟踪。结果显示CD44＋表达的细胞在15h内可以形成类器官且显示出更大的平均运动性（140-240μm），而CD44−肿瘤细胞无法形成类器官且在水凝胶移动缓慢（〜30μm）。 

 

 

图3：不同口咽鳞状细胞癌-细胞表型的类器官形成能力和运动性。（b）根据CD44和NGFR的表达获得单个细胞的平均累积运动性，对五个表型的类器官进行重复监测。

 

 

参考文献：

[1] Gomez Jimenez D, Carreira Santos S, Greiff L, et al. Subpopulations of Organoid-Forming Cells Have Different Motility. Applied Sciences. 2020; 10(13):4673.

https://doi.org/10.3390/app10134673.

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