01 实验背景介绍

实时活细胞成像是研究细胞动态的方法之一，贴壁细胞由于他们移动速度缓慢实现实时追踪并不成问题，然而悬浮细胞，如造血干细胞或淋巴细胞，由于他们迁移迅速会很快离开视野使得实时追踪悬浮细胞充满了挑战。

除此之外，大多数的活细胞成像系统为了实现对细胞的实时追踪需要对细胞进行染色或使用荧光标记，而这些方法都可能通过某种不受控制的方式激活细胞而影响研究的生理相关性（Gilner et al，2007）。

为了更好地同时解决这两个问题，Daniel Day（Day et al，2009）开发了一种使用无涂层的硅树脂微格（microgrid）来对悬浮细胞进行成像。这些微细网格不会对细胞造成任何伤害或影响，并且这些微格设置了60um的网格壁可以框住悬浮细胞，可以在不限制细胞运动和细胞间相互作用的前提下防止细胞逃出视野，从而实现对悬浮细胞的实时追踪。

这篇文章详细展示了Daniel如何利用活细胞成像系统HoloMonitor M4以无标签的方式研究脐带血衍生的CD34+细胞对细胞因子刺激的动态变化。

02 材料和方法

细胞分离和培养

人类脐带血（UCB）使用autoMACS pro (Miltenyi Biotec, France)通过免疫磁选分离出人类CD34+细胞，该磁选基于UCB样本单核细胞部分的人类CD34表达。

微格准备

一个由聚二甲基硅氧烷（PDMS--生物相容性硅胶）制成的含有1024个微孔（125微米宽，60微米深）的微格（Microsurfaces，澳大利亚）被放置在一个无涂层的35毫米培养皿中，底部为聚合物盖玻片（图1）。用镊子将微网从其支架上剥离，直接放在在培养皿中。在微网格上加入200ul100%的酒精消毒5分钟。然后移出酒精并将微格在通风橱中晾晒30分钟。然后将五千个细胞加到网格中并放置10分钟进行沉淀。根据泊松定律，大约有30%的微格中只含有一个细胞。

图1. 准备微格的方法。

实时成像

作者用HoloMonitor M4在培养箱中对细胞进行实时成像，作者一共选取了20个位点，每个位点覆盖4个微孔，每10分进行一次成像并持续4天。之后用HoloMonitor App Suite软件处理图像并导出数据。导出的数据在用R处理细胞参数偏心率和运动性后用于制图。参数偏心率描述了细胞偏离圆形的程度。0的值对应于一个圆，细胞越细长，偏心率值就越高，接近1。运动性参数给出了细胞在细胞路径的起点和终点之间的实际距离。

03 实验结果

形态学测定

以前的研究已经证明，细胞形态和CD34+细胞的分化潜力之间存在着紧密的联系。在CD34+脐带血细胞部分已经描述了两种主要的形态形式。具有阿米巴形状的极化细胞能够通过剧烈的形状变化进行主动运动，通常在一端拥有一个被称为尿囊的大突起。这些细胞已被发现保留了原始的自我更新和干细胞功能（Gorgens et al，2014）。第二种形态类型是圆形。这些细胞已经被认为是已经参与了分化（Wagner et al，2004）。

用Holomonitor M4获得的图像可以很容易地观察到之前描述的两种细胞形态。从隔离和操作的压力中恢复后，创始细胞（即最初被放入微网格的细胞）在几小时内获得了极化的形态，发展出尿囊并开始了主动运动阶段（图2）。

图2A：显示96小时内九个完整的微孔的视场。B：左图显示了中央微孔的放大图。0h时的细胞是小而圆的。右图是同一放大的微孔在80h时的视图。三个圆形细胞位于微孔的左上方，三个极化细胞在右侧可见。可见的极化细胞的尿囊用白色箭头表示。比例尺为100 µm

运动性和偏心率的量化

为了说明该系统量化细胞形状和运动的能力，作者监测了细胞的运动性和偏心率。极化的细胞往往有很强的运动能力，而圆形的细胞则表现出低的运动能力。对偏心率的量化也很好的帮助区分这两种形态（极化与圆形）。图3展示了这两种细胞形态在行为上的差异，在四个小时的监测中，平均偏心率为0.36±0.15的圆形细胞显示出低运动性，其运动轨迹不超过100微米，仅限于微孔上角的一个非常小的区域。而邻近的微孔中的极化细胞显示出宽阔的轨迹，几乎覆盖了40%的微孔表面面积，运动能力攀升至600微米，而其偏心率平均为0.72±0.12（图3C）。

图3. A显示了被监测4小时的两个细胞。左边的微孔含有两个细胞，其中一个细胞形状为圆形，运动量小。其细胞轨迹以蓝色显示。右边的微孔含有一个极化的细胞，其轨迹显示为绿色。B小组显示了这些细胞在研究期间的个别图像。面板C显示了这两个细胞（绿色为极化细胞，蓝色为圆形细胞）的运动性和偏心率的量化情况。

细胞在前96小时内的生长情况

细胞的干质量可以通过定量相位成像来确定（Barer 1952，Acnou et al，2015）。溶液的折射率被证明是溶剂折射率和与溶质质量密度成比例的增量之和。作者应用这种测量技术来区分第一代与第二代的细胞生长演变（图4），而这种方法的优点是可以避免对样品的使用任何的标记或进行染色。

结果显示，第一代与第二代相比，细胞衰老过程明显不同。此外，HoloMonitor M4系统使我们能够根据光学体积来量化大量细胞的干质量，证明与第一代相比，分裂时间的缩短与生长的差异较小有关（图4 C）。

图4. B组显示了10个细胞（A组中展示的编号）的光学体积的动态变化。C展示了总共34个细胞的光学体积的统计，这些细胞是研究开始时（Gen1 Beg）和他们的细胞分裂或死亡前（Gen1 End）的第一代细胞，以及他们的子细胞在age 0时（Gen2 Beg）和他们的细胞分裂或死亡前（Gen2 End）。少数没有任何明显生长的细胞对应于垂死的细胞。

04 实验讨论

在这份报告中，我们展示了搭配微格搭配活细胞成像系统在单细胞水平上跟踪悬浮细胞的细胞形态、细胞运动和细胞生长的可行性。

HoloMonitor M4采用的全息成像是一种无标签的方法，因此避免了任何可能改变细胞的标签，特别是造血性CD34+干细胞（Gilner et al，2007）。而微网格阵列和定量实时成像的结合，克服了追踪悬浮细胞有可能离开视野造成的实时追踪的困难。

与传统方法相比，使用HoloMonitor M4的强大优势之一是易于量化关键参数，如可直接量化与细胞生长相关的光学体积。此外，它还提供了捕捉细胞亚群（如垂死细胞）中罕见事件的可能性。这种方法的总体优势是，由于自动图像分析只需要少量的人工修正，因此大大节省了时间，准确估计了细胞的干质量，并可以同时研究不同的条件。

作者在本报告中表明，活细胞成像系统结合微细网格为悬浮细胞的单细片上分析铺平了道路。此外，作者所展示的监测细胞运动和轨迹模式的能力对许多基础研究领域或对细胞运动起关键作用的疾病研究，如转移性癌症疾病，提供了更多的可能性。

05 参考文献

Aknoun S, Savatier J, Bon P, Galland F, Abdeladim L, Wattellier B, Monneret S. Living cell dry mass measurement using quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 2015; 20(12):126009.
Barer R. Interference Microscopy and Mass Determination. Nature 169, 366–367 (1952). doi: 10.1038/169366b0
Cosette J, Moussy A, Paldi A, Stockholm D. Combination of imaging flow cytometry and time-lapse microscopy for the study of label-free morphology dynamics of hematopoietic cells. Cytometry A. 2017 Mar; 91(3):254-260.
Day D, Pham K, Ludford-Menting MJ, Oliaro J, Izon D, Russell SM, Gu M. A method for prolonged imaging of motile lymphocytes. Immunol Cell Biol. 2009 Feb; 87(2):154-8. doi: 10.1038/icb.2008.79.
Gilner JB, Walton WG, Gush K, Kirby SL. Antibodies to stem cell marker antigens reduce engraftment of hematopoietic stem cells. Stem Cells. 2007; 25:279–288.
Gorgens A, Ludwig AK, Mollmann M, Krawczyk A, Durig J, Hanenberg H, et al. Multipotent hematopoietic progenitors divide asymmetrically to create progenitors of the lymphomyeloid and erythromyeloid lineages. Stem cell reports. 2014; 3(6):1058–72.
Moussy A, Cosette J, Parmentier R, da Silva C, Corre G, Richard A, Gandrillon O, Stockholm D, Páldi A. Integrated time-lapse and single-cell transcription studies highlight the variable and dynamic nature of human hematopoietic cell fate commitment. PLoS Biol. 2017 Jul 27; 15(7):e2001867.
R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. https://www.R-project.org/.
Wagner W, Ansorge A, Wirkner U, Eckstein V, Schwager C, Blake J, et al. Molecular evidence for stem cell function of the slow-dividing fraction among human hematopoietic progenitor cells by genome-wide analysis. Blood. 2004; 104(3):675–86.

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