细胞周期(cell cycle) 是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

 

1.细胞周期的主要阶段

细胞周期通常被分为四个主要阶段。前三个阶段通常被称为间期，它们为第四个阶段—有丝分裂做准备。细胞体积不断增加并增加mRNA、蛋白质和细胞器的产量，为后续阶段做准备。

1.2 S期—DNA合成

mRNA和蛋白质的产量降低，细胞专注于复制其所有的DNA，为每条染色体创造一个副本。这两个相同的拷贝，称为姐妹染色体，在一个称为中心点的地方相互连接在一起。

DNA已被复制，所以染色体由两个相同的姐妹染色体组成，在中心点连接在一起。

1.3 G2期—为细胞分裂做准备

细胞继续生长并合成最后阶段所需的蛋白质和细胞器。

1.4 M期—通过有丝分裂形成子细胞

核膜破裂，释放出染色体。姐妹染色单体分离，形成两个相同的细胞核，被拉到细胞的两侧。然后，它将细胞膜和细胞质分成两个相等的部分，将DNA和细胞器分在它们之间。两个遗传上完全相同的子细胞就这样产生了。

细胞完成M期后，两个子细胞再次进入G1期。从这里开始，它们可以继续细胞周期并再次进行分裂，或者离开细胞周期并停止分裂。退出细胞周期的细胞进入G0期，它仍然具有完全的功能，但不再进行分裂。一些细胞永远不会再离开G0期，如大多数神经细胞，而其他细胞可以重新进入G1期，并在必要时继续进行细胞周期。像大多数上皮细胞一样，一些细胞从未进入G0期，但在其一生中继续分裂。

 

2.细胞周期检查点

为了确保细胞周期的每个阶段都能正确进行，每个阶段后有一个检查点。细胞周期检查点是一种控制机制，在细胞进入下一个步骤之前必须满足某些条件。检查点失败会导致细胞周期停滞，阻止细胞在解决问题之前继续进行。

目前，研究细胞周期的最常见方法是使用流式细胞术。然而，流式细胞术存在一些缺点：(1) 需要准备大量的细胞样品，最终可能会造成细胞样品的浪费；(2) 样品必须为单细胞悬液；(3) 不能确定组织结构，一些罕见的大细胞难以分析；（4）无法检测分泌蛋白等。

因此，在细胞周期研究中，使用HoloMonitor®活细胞成像系统有几个好处：它是完全非侵入性的，不使用细胞毒性的染色剂；它不需要任何样品预处理；所研究的细胞不会被浪费，而是可以继续使用；它可以直接在常规培养箱内操作。

 

02 分享具体案例

以下是使用HoloMonitor M4研究细胞周期的具体案例：

Externally added cystatin C reduces growth of A375 melanoma cells by increasing cell cycle time

 

半胱氨酸组织蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X（或Z）的天然抑制剂家族称为胱抑素。人类胱抑素中含量最高的是胱抑素C。它是一种2型胱抑制素，存在于体液、组织和细胞中。胱抑素C对几乎所有的半胱氨酸蛋白酶都有抑制作用。有研究表明，胱抑素可以调节细胞增殖，保护细胞免受诱导细胞死亡的氧化应激并可以影响细胞因子释放。人体细胞生长和细胞内蛋白水解受到天然分泌的胱抑素的影响，因此它可能被用于抑制肿瘤生长。

在这篇文章中，H.Wallin和同事采用HoloMonitor M4活细胞成像仪对A375黑色素瘤细胞增殖、细胞周期长度和细胞形态（面积和光学厚度）进行研究，旨在探讨外部添加的胱抑素C是否能够影响黑色素癌细胞的增殖，从而抑制肿瘤的生长。

 

2.1 胱抑素C对A375细胞增殖的影响

为了研究A375细胞群的生长，我们使用HoloMonitor M4活细胞成像仪实时跟踪细胞。在48小时内每小时拍摄一次全息图像，在每个图像中定义和计数细胞以绘制生长曲线（图1）。与对照组细胞（146 000 ± 58 000）相比，5 µM胱抑素C的存在使细胞数减少到55%（81 000 ± 37 000）。以上结果表明，胱抑素C会降低A375细胞增殖率。

图1 A375细胞生长曲线

 

2.2 胱抑素C对A375细胞形态（面积和光学厚度）的影响

为了探究胱抑素C是否会诱导细胞死亡，我们使用HoloMonitor M4研究了A375细胞与胱抑素C共培养的细胞形态学。在12和24小时后，与对照组相比，使用胱抑素C的培养物中的细胞数量明显减少，但细胞看起来健康，并在整个实验过程中继续增殖（图2A）。相比之下，在100 µM H2O2（已知可诱导A375细胞死亡）存在下培养的A375细胞面积较小且不增殖（图2A）。基本上，用H2O2处理的细胞在12小时后显示出小面积和高厚度（图2B）。另一方面，添加胱抑素C培养的A375细胞在面积和厚度方面与对照细胞相似。

以上表明胱抑素C不会诱导细胞死亡。

图2 用H2O2或胱抑素C处理的细胞形态学。(A) 将A375细胞与H2O2或胱抑素C孵化，并在0、12和24小时后采集数字全息显微镜图像，细胞厚度以颜色编码显示，如右侧色条所示。(B)细胞的面积（µm）与平均光学细胞厚度（µm）的散点图。

2.3 胱抑素C对A375细胞周期长度的影响

为了进一步研究外源胱抑素C对A375细胞分裂影响，使用HoloMonitor M4追踪A375细胞。

对得到的每个细胞分裂的子细胞进行标记，并在后期图像中继续追踪（图3）。并由此构建生成树和计算单个细胞的细胞分裂时间。

图3. 使用HoloMonitor M4追踪A375细胞分裂的数字全息图像。（A，B）相隔5分钟拍摄的相同位置的图像。

图4显示了在培养基中没有胱抑素C（左）或有胱抑素C（右）的情况下生长的A375细胞的生成树的例子。当A375细胞在胱抑素C存在下培养时，细胞周期更长，细胞分裂次数更少

图4. 存在或不存在胱抑素C的情况下生长的A375细胞的生成树

具体来看，A375细胞周期的时间存在明显差异。一些细胞分裂的时间是细胞周期中位数的两倍以上，特别是在细胞周期1和细胞在胱抑素C存在下生长的情况下（图5A）。

在分析所有细胞时，48小时中完成的细胞周期数也有很大的变化。少数细胞（<5%）没有移动或分裂。其他细胞周期短，分裂次数多。最常见的是3次完成的细胞分裂，无论是否添加胱抑素C（图5B）。然而，在胱抑素C的存在下，只有11%的被追踪的细胞成功地分裂了4次，而26%的对照组细胞出现了4次分裂，甚至有些细胞出现了5次分裂（图5B）。

以上结果表明，外部添加的胱抑素C减少了A375细胞分裂的次数并增加了细胞周期时间，特别是第一个细胞周期。

图5. 外部添加的胱抑素C增加了细胞周期时间，减少了A375细胞分裂的次数。

 

HoloMonitor M4采用高分辨率成像技术，它能够实时检测和定量单个和整个细胞群并且无需事先提取细胞、染色或将细胞暴露于有害光源。该技术有可能发展成为一种快速且经济高效的癌症治疗效果临床前监测方法。在这篇文章中，使用HoloMonitor M4观测可知，胱抑素C通过延长细胞周期时间影响黑色素瘤细胞生长。因此，胱抑素C具有调节癌细胞增殖的能力，并可能用于抑制肿瘤生长。

 

产品介绍

 

在细胞周期研究中，HoloMonitor M4除了上述案例中提及的能监控细胞分裂次数和确定细胞周期长度以外，还能用于研究细胞周期阻滞、测量有丝分裂持续时间、捕捉异常细胞分裂以及研究细胞周期进展等。HoloMonitor M4可以精准定位单个细胞，提供完整的单细胞迁移轨迹，速率以及其他多达30种细胞形态学参数。除此之外，用户可以从同一个实验样品中获取其他相关信息，例如细胞形态参数，繁殖速率等，使其真正成为一款智能化、全性能、全自动的活细胞成像分析系统，为您带来全新的活细胞成像体验。
 

参考文献

[1] Wallin H, Hunaiti S, Abrahamson M. Externally added cystatin C reduces growth of A375 melanoma cells by increasing cell cycle time. FEBS Open Bio. 2021 Jun;11(6):1645-1658. doi: 10.1002/2211-5463.13162.